METODI INTEGRATI DI CONTROLLO DELLA QUALITÀ

MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO MOLECOLARE

Metodo
Le acque superficiali possono ospitare diversi tipi di batteri che costituiscono una comunità microbica specifica. Il numero dei batteri presenti dipende dai nutrienti e dalle caratteristiche chimico-fisiche dell'habitat. L'immissione di reflui fognari o di sostanze tossiche per gli organismi viventi possono alterare profondamente l'equilibrio di una comunità microbica. Generalmente le sostanze inquinanti possono far aumentare la quantità di microrganismi ed abbattere la biodiversità esistente.

In questa piastra si distinguono le differenti colonie che possono permettere
una identificazione fenotipica ma non molecolare

Con le tecniche molecolari si è voluto individuare i ceppi batterici presenti in modo da avere un valore della biodiversità microbica, e mediante le singole impronte ottenere anche informazioni su eventuali tipi di inquinamento intervenuti nel tempo. Infatti i singoli ceppi batterici possono svelare le caratteristiche abiotiche dell'ambiente acquatico in relazione alle loro capacità metaboliche (la presenza ad esempio di batteri tolleranti il fenolo può indicare un inquinamento di fenolo).
L'elemento non tradizionale di queste tecniche è dovuto all'utilizzo di metodi molecolari che agiscono sul DNA dei vari ceppi e permettono in questo modo di valutare le differenze, individuando una specie di "Carta d'identità" dello specifico batterio (il Fingerprinting o impronta molecolare). Il confronto con le banche dati permette di risalire all'identificazione, poiché i ceppi della maggior parte dei microrganismi sono "schedati".
Ci troviamo di fronte ad una metodica innovativa che sicuramente richiede una interpretazione dei dati molto attenta e necessariamente comparata con i risultati delle analisi chimiche e microbiologiche convenzionali.

Procedimento
I campioni in questo caso utilizzati sono esclusivamente quelli delle stazioni Frassineto e Le Capannine lungo la Sieve.
Per risalire all'identità batterica ci si basa sull'amplificazione di un gene ubiquitario nei nostri ceppi batterici e codificante per una subunità ribosomale. Il gene possiede parti costanti ed altre interne variabili dove maggiormente avvengono mutazioni spontanee e sono proprio queste che consentono di individuare le differenze genetiche dei vari ceppi batterici. Si è trattato quindi di effettuare le seguenti operazioni:

• Estrazione del DNA dalle colonie batteriche che erano state allestite precedentemente con i campioni di acqua del torrente
• Identificazione con primer specifici e amplificazione del gene 16rS mediante la tecnica chiamata PCR capace di produrre 10 miliardi di copie di un frammento di DNA in poche ore.
• Frammentazione del gene 16rS attraverso l'azione degli enzimi di restrizione che sono particolari forbici molecolari capaci di riconoscere specifiche sequenze di basi ripetitive (polindromi) e quindi romperne i legami.
• Elettroforesi degli amplificati su gel di agarosio contenente bromuro di etidio, che permette l'osservazione del loro profilo genetico "l'impronta molecolare". Questa ci appare agli UV come un codice a barre.
• Raggruppamento degli isolati batterici mediante il loro profilo genetico.
• Estrazione e purificazione del DNA dal gel di agarosio.
• Sequenziamento del DNA dei geni dei vari tipi di batteri individuati, cioè identificazione della sequenza di basi azotate dei geni.
• Identificazione dei ceppi batterici tramite le Banche dati in Internet che mettono a confronto le sequenze da noi individuate con quelle note.

Il procedimento prevede l'estrazione dalle cellule batteriche
mediante rottura delle membrane tramite lisi termica


L'elettroforesi su gel di agarosio permette di evidenziare
i diversi frammenti originati dai vari ceppi batterici osservabili tramite raggi UV

Risultati
Questo tipo di indagine ha messo in luce la presenza di un basso numero di ceppi batterici in entrambi i siti (5 in un sito e 4 nell'altro) di cui 3 risultano essere contemporaneamente presenti in entrambe le stazioni.
Ci si aspettava una differenza che non si è presentata e questo fa pensare ad una condizione non di buona qualità anche per la prima stazione di campionamento visto la bassa presenza di ceppi batterici. Tale valutazione è confermata anche dai risultati microbiologici convenzionali e dagli indici IBE e IFF.
Il sequenzamento è stato effettuato per i 2 aplotipi (tipi genetici) più numerosi presenti in tutte e due le stazioni e da questo si sono identificati i ceppi di Pseudomonas brennerii e Pseudomonas corrugata.
Pseudomonas brennerii è una nuova specie di Pseudomonas, Gram-negativo, flagellato. Produce pigmenti fluorescenti, è stato isolato in ambiente acquatico e terrestre ed è endofita nelle piante. Il suo valore clinico non è ancora conosciuto.
Pseudomonas corrugata è un Batterio Gram-negativo è stato ritrovato in vari ambienti. Ha capacità di degradare la 4-cloroanilina in presenza di anilina (veleno e agente cancerogeno) e la sua combustione libera fumi e gas irritanti.
A questo punto sarebbe interessante sequenzare anche gli altri ceppi e ripetere l'esperienza in periodi successivi per indagare in modo maggiormente approfondito.

I risultati della "corsa" dei frammenti del DNA dei nostri batteri
mostrano 6 tipologie batteriche diverse